초음파 이용 뼈와 근육 치료

저강도 펄스 초음파 치료: 건-골 결합부 치유를 촉진하기 위한 가능성 있는 전략

골 터널 내로의 건 이식의 통합은 임상적인 많은 어려움을 받고 있다. 성공적인 전방십자인대(ACL) 재건은 골 터널 내에 건 이식의 확고한 치유를 필요로 한다.

골로의 이식 치유의 강화는 초기의 공격적인 재활과 상해전 활동 수준으로 빠르게 돌아가기 위해 중요하다.

수술 후 건-골(T-B) 치유를 강화하는데 편리하고 효과적이며 값싼 절차가 없는 실정이다.

저강도 펄스 초음파(LIPUS)는 국소 혈류 관류와 혈관형성을 향상시키고, 연골 성숙을 자극하고, 골아세포의 분화와 증식을 강화하고, 중간엽 줄기세포(MSC)의 골 분화를 유도하여, ACL 재건의 재활 초기 단계에서 T-B 치유에 대해 잠재적인 비침습적 도구가 될 것으로 보인다. 재활을 가속화하고 정상 생활로 좀 더 빨리 돌아가기 위해, LIPUS가 가정에서 T-B 터널 치유를 자극하기 위해 사용될 수 있는 것은 가까운 미래에 가능한 일이다.

본 리뷰의 목적은 LIPUS가 세포 및 분자적 수준에서 T-B 치유를 어떻게 촉진하는지를 증명하고, 동물 모델에서의 시험을 기술하고, 연구에 대한 미래 방향을 제시하기 위함이다.

저강도 펄스 초음파 치료: 건-골 결합부 치유를 촉진하기 위한 가능성 있는 전략

전방십자인대(ACL) 재건 술 후, 골 터널 내로 이식된 건의 치유는 복잡하고 불명확한 생물학적과정이다. ACL 대체에 대해 사용된 건 이식물의 골성결합(osteointegration)은 불만족하게 될수 있고, 수술 후 전-후방 이완과 관련될 수 있다. 골 터널 내 건-골(T-B) 치유는 건과 골 사이 처음 형성되는 섬유혈관성 접점 조직 내로 골의 통합을 통해 일어난다.

T-B 접점 치유의완전성 증가는 골 중간엽 줄기세포(MSCs)의 사용(Soon et al 2007), 인산칼슘(Mutsuzaki etal 2011), 골수 또는 골막(Chen 2009; Karaoglu et al 2009), 골형성단백질-2(BMP-2)(Hashimoto et al 2007), 관절액 MSCs(Ju et al 2008), 주사용 인산3칼슘(트리칼슘 포스페이트)(Huangfu and Zhao 2007), burshite 인산칼슘 시멘트(Wen et al 2009), TGF-β3(Kovacevic et al 2011), G-CSF(Sasaki et al 2008), 고압산소 치료(Young andDyson 1990), 마그네슘-기반 골 접착제(Gulotta et al 2008), 쇼크웨이브(충격파) 치료(Wanget al 2011)와 같은 많은 다른 교정 전략을 채택함으로써 시도되어 왔다(Fig. 1).

그러나 쇼크웨이브 치료가 이식된 건과 골 터널 사이 조기 치유를 강화하기 위한 현재 유일한 외인성 자극 방법으로 보고되었다.

이러한 교정 접근은 시간이 소요되고, 불편하고, 비용이 비싸며, 수술에 대해 깊은 지식이 필요하다. 더욱이, 이러한 접근의 일부는 아직 실험적 연구 단계에 있으며, 일상적인 임상 실습에서 활용되고 있지 않다.

30mW/cm2의 자극으로 저 강도 펄스 초음파(LIPUS)는 확립되고, 널리 적용되며, FDA(미식약청)에서 골절 및 부정유합에서의 골 치유를 강화하는데 승인된 방법이다(El-Mowafi and Mohsen 2005; Angle et al 2011). LIPUS는생물학적 조직 내로 고주파수 음향 압력 파로써 피부를 통하여 역학적 에너지가 전달되는 비파괴적인 양식(장비)이다(Qin et al 2006a).

초음파 에너지의 흡수는 초음파가 통과할 때 조직의 감쇠와 흡수에 따라 달라진다.

LIPUS는 골아세포 증식, 연골 내 골화, in vitro 상에서 미네랄화의 증강에 대해 즉각적인 기계적 자극을 제공한다(Doan et al 1999; Reher et al2002; Leung et al 2004).

접점에서의 더 좋은 T-B 수리는 T-B 재접착 부위에서 콜라겐 섬유의 진행성 성장, 미네랄화, 치유 조직의 성숙으로 인해 실험적으로 밝혀졌다(Rodeo et al1993; Qin et al 1999; Leung et al 2002). 따라서, 우리는 LIPUS가 골형성 및 건 반흔 조직의 성숙을 강화할 수 있을 뿐만 아니라 ACL 재건 후 건이식물-골 결합부에서 섬유 연골영역을 복원시킬 수 있다고 결론 내렸다.

T-B 치유의 개요

T-B 결합은 사람과 많은 동물 모델에서 건과 골 사이의 치유로써 기술되고 있다(Rodeo et al 1993; Clark and Stechschulte 1998; Demirag et al 2005; Kanazawa et al 2006). T-B 접점은 직접적 및 간접적 분류로 나눠진다.

직접적인 접점은 건, 미네랄화되지 않은 섬유연골, 미네랄화된 섬유연골, 및 골로 구성되며, 간접적 접점은 건, Sharpey 섬유, 골로 구성된다. 많은 시험에서 ACL 교정 수술 후 사람 환자들의 T-B 조직학을 연구하였다(Peterson and Laprell 2000; Robert et al 2003).

골절 치유 진행은 일반적으로 염증, 연가골, 경가골, 리모델링 단계로 나눠진다.

T-B 결합부에서 골 터널은 "신선 골절" 부위로써 작용하며, 수복 과정은 4개의 전형적인 골 치유 단계 중 초기 염증 단계, 재생된 섬유연골 영역-양 구조의 새롭게 형성된 골 단계, 무층골(woven bone) 리모델링과 섬유연골성 결합의 성숙으로 특징화된 단계를 포함하여 처음 3 단계와 비슷하다(Wong et al 2003).

회복단계는 골절 후 4-5일 내에 시작된다. 다능성 MSCs는 이 부위에 침습하고 섬유아세포, 연골아세포, 골아세포로 분화한다.

이들 세포는 골절 연가골의 형성과 이식물 내로 침투하는 무층골에 관여한다.

국소 및 전신적으로 많은 인자들이 T-B 치유 과정에 연관되어 있다.

초음파 펄스(Ultrasound Pulsing)

1 혈관생성(Angiogenesis)

충분한 혈관 침습은 연골내 골형성, 골절 치유, 연부조직 수복에 대해 필수적인 전제조건이다(Bolander 1992). LIPUS는 국소 혈류 순환을 증가시키고, in vivo와 in vitro 모두에서 혈관생성을 자극한다.

0.1 W/cm2 강도 SATA에서의 치료적 초음파는 성체 랫드의 옆구리 피부에서 전층 절제 병변에서 새로운 혈관의 형성을 직접적으로 자극하였다(Young and Dyson 1990). 상해 5일 후까지, 대조군과 비교하여 초음파 치료된 창상의 육아 조직의 등가 부위에서 더 많은 혈관이 있었다.

치료적 초음파는 인터루킨-8, bFGF(염기성섬유아세포성장인자), VEGF(혈관내피성장인자)와 같은 혈관생성-관련 사이토카인의 생산을 유의하게 자극한다고 보고되고 있다. 초음파 기계 모두 유의한 결과를 나타내었다: 최적의 강도는 45kHz 초음파의 경우 15 및 30mW/cm2 SATA이고, 1MHz 초음파의 경우 0.1 및 0.4W/cm2 SATA이다(Reher et al 1999).

추가 연구는 LIPUS가 일산화질소(NO)와 HIF-1α에 의해 매개되는 사람 골아세포에서 VEGF-A 발현을 유의하게 올려준 점을 밝혔다(Wang et al 2004).

그러므로 LIPUS는 조직 관류 향상 및 혈관생성으로 T-B 결합에서의 치유를 자극한다(Fig. 2a-2d).

2 연골 성숙(Cartilage maturation)

여러 연구들이 LIPUS가 골 성장 및 수복 동안 골형성을 자극함을 확인하였다(Warden et al 2000; Nolte et al 2001; Rubin et al 2001). 골 칼라(bone collar) 양과 석회화된 연골의 퍼센트에서의 유의한 증가는 3 또는 6일의 기간 동안 20분/일로 LIPUS(30mW/cm2; 1.5MHz)로 초음파 치료의 결과로써 밝혀졌지만, 세포의 수는 유의하게 변화하지 않았다.

이러한 결과는 연골내 골화에서의 LIPUS의 자극적 효과는 세포 증식을 변화시키는 것이 아니라, 골세포 분화와 석회화된 기질 생산의 자극에 의한 것임을 의미한다(Korstjens et al 2004).

이러한 관찰들은 골절 치유의 초음파 자극에 관한 보고와 일치한다(Shimazaki et al 2000). 경가골 부위, 골 미네랄 밀도(BMD), 기계적 검사 결과는 대조군과 비교하여 LIPUS(30mW/cm2, 20분씩 매일)을 받은 그룹에서 유의하게 높았다.

십자 인대 재건술 동안 신선 골절 드릴링으로써의 역할을 하는 ACL 재건 수술 내 골 터널은 연골 성숙을 자극하기 위해 LIPUS 치료의 가장 민감한 부위일 수 있다.

3 골아세포 성장(Osteoblasts growth)

초음파 자극이 골 세포 활성에 작용하는 특정 기전은 여전히 알려지지 않았다. 그러나, 물리적 기전 측면에서, 초음파는 세포계에 물리적 힘을 제공한다. 초음파에 의해 유도되는 음향 공동현상은 초음파 주파수에 따라 매우 달라지는 것으로 고려된다(Yoichiro et al 2005).

공동현상 효과와 기계적 교란을 통해, LIPUS는 세포막의 기계적 변형에 의해 직접적으로, 또는 세포 변형으로 야기된 전기적 영향에 의해 간접적으로 세포막 투과도를 증가시킨다(Liu et al 2006; Cai et al 2007)(Sun et al 2001).

세포막 변화를 뒷받침하는 정확한 물리적 기전은 아직 완전히 이해되고 있지 않다. 초음파 단독 혹은 외부에서 투여된 미세버블과의 조합의 효과는 쇼크웨이브(충격파)와 마이크로제트(microjet)의 형성(Ohl et al 2006; juffermans et al 2008)과 음향 마이크로유동(acoustic microstreaming)과 매우 연관되어 있다(karshafian et al 2009).

더욱이, LIPUS는 세포로의 산소와 영양분 수송률을 증가시킴으로써, 그리고 세포로부터 버려지는 폐기산물의 수송률을 증가시킴으로써 세균과 생리학적 세포의 증식을 자극한다(Pitt and Ross 2003).

또다른 보고는 초음파 노출이 골아세포에서 cyclooxygenase-2 메신저 RNA(mRNA)를 상향조절함으로써 잠재적인 염증 매개체이자 골 리모델링에 관여하는 프로스타글란딘 E2(PGE2) 합성을 증가시킨다고 밝혔다.

LIPUS는 또한 골아세포 투과도를 북돋우고, 골아세포 내로 산소와 영양분의 수송을 촉진하고 연골아세포의 성장을 강화하는 가능성을 갖는다는 점은 타당하다.

4 MSC 골 분화(MSC osteogenic differentiation)

MSCs는 골아세포, 연골세포, 지방세포를 포함하여 다양한 세포 종류로 분화하는 다분화능 줄기세포이다.

그러나 분화되는 정도는 개인에 따라, 분화가 어떻게 유도되는가(예, 화학적 vs 기계적 vs 물리적)에 따라 다양하다.

Lim et al(2004)은 MSCs로 햄스트링 건 이식을 코팅하는 것이 콜라겐 섬유 및 반흔 조직 보다, 정상적인 ACL 삽입의 연골 삽입과 유사한 연골의 사이 영역을 통해 치유로 이어진다고 보고하였다.

LIPUS가 in vivo에서 MSC 연골형성에 대한 미세기계적 신호를 제공할 수 있다고 보고되고 있으며, LIPUS in vitro 선행조건은 in vivo에서 MSCs의 연골형성 분화를 상향조절하는데 효과적인 단소가 될 수 있음을 강력히 나타낸다(Cui et al 2007). MSCs의 LIPUS 치료는 기질 형성, 콜라겐 타입 II과 같은 연골형성 마커의 발현, metalloprotease-2의 조직 억제제의 발현, 단층 배양에서 연골형성 표현형을 유지시키는 능력을 증가시킨다(Lee et al 2006).

그러므로, LIPUS는 MSC 골형성 분화를 증가시키고, 생존력을 강화시키고, T-B 치유의 리모델링을 궁극적으로 가속시킨다고 결론 내릴 수 있다.

(a)혈관형성-관련 사이토카인의 생성을 촉진함으로써 혈관형성을 가속화시킴

(b) 골 세포 분화와 석회화된 기질 생산에 의한 연골 성숙을 촉짐시킴

(c) 영양소 교환 및 상관관계 있는 신호 분자를 조절함으로써 골아세포 성장을 강화시킴

(d) MSCs의 연골 분화능을 상향조절함으로써 MSCs의 연골 분화를 유발함

LIPUS의 물리적 기전(Physical mechanisms of LIPUS)

LIPUS는 골절 치유의 가속, 지연형 또는 부정유합의 치료, 골 신장에 대해 약 20-30분씩 매일 적용이 권고된다(Busse et al 2009). 초음파의 잠재적인 생물학적 작용은 두가지 주된 기전으로부터 온다: 열 효과 및 기계적 효과(비-열).

1 열 효과(Thermal effect)

초음파가 체내에서 전파될 때, 초음파 에너지는 조직의 치밀도에 비례하여 흡수된다. 초음파 신호의 흡수는 체내 조직의 온도의 상승으로 이어진다(Liu et al., 2010). 이러한 열 효과는 저 주파수 초음파에 대해 상당히 작지만, MMP-1과 콜라겐가수분해효소와 같은 일부 효소들은 온도에서의 작은 변화에 매우 민감하다(Welgus et al., 1981). 열 불활성화는 효소의 변성에 중요한 기전 중 하나이다.

2 음향 공동현상(Acoustic cavitation))

공동현상은 초음파 에너지에 의해 형성된 가장 큰 비-열 효과이다(Doktycz and Suslick 1990; Prozorov et al., 2004). 공동현상은 생물학적 조직에 변화를 야기하는, 특히 막 투과성 증가, 주된 기전으로 고려된다(sivakumar et al., 2005). 공동현상의 2가지 다른 타입이 있다: 안정적 공동현상과 일시적 공동현상. 전자는 거품(버블)을 생산하고, 이는 수많은 음향 주기에 대해 존재하고, 모든 거품(버블)의 반경은 평형 값에 대해 다양하다. 후자는 그들의 평형에 대해 불안정한 방식으로 진동하는 거품(버블)을 형성하며, 단일 압축 반주기 동안 맹렬하게 붕괴하기 전에, 2-3배 공명 크기로 확대된다(Feril and Kondo 2004). 일시적 공동현상 작용은 정상 세포 손상의 주된 기전으로 여겨진다.

3 물질 전달 강화(Mass transfer enhancement)

초음파는 많은 단계와 균질계에서 물질 전달과 반응률을 촉발시키는 액체 매질의 운동을 강화한다(Bar, 1988). 경계층, 막 및/또는 세포벽, 세포질은 이 과정이 발생하는 3가지 영역이다. 진동의 가스 거품(버블)이 음향 장 순환 액체 운동 주위에서 형성된다고 받아들여지고 있으며, 마이크로유동(microstreaming)이라고 일컫어진다. 이 사실은 효소의 활성 부위 또는 세포로 시약의 흐름과 매질로 반응 산물의 흐름을 야기하고, 결국 회전률 양을 증가시킨다.

T-B 치유에 대한 LIPUS의 in vivo 증거(In vivo evidence of LIPUS for T-B healing)

T-B 결합부에서 어떻게 골 형성을 자극하고 미네랄화를 강화하는지는 임상적으로 중요하다. 가능한 접근 중 하나는 LIPUS와 같은 생물리적 중재, 기계적 자극, 전기자기장의 사용이다. 이러한 양식은 골절 및 연부조직의 치유를 가속화하게 해준다. LIPUS는 열에너지, 골절 부위에서의 증가된 혈관화, 세포내 칼슘 신호의 조절, 연골 석회화와 성숙의 강화에 응하여, 기계적 신호 변환, 유전자 발현의 유도, 효소 활성화에 의해 골절 치유에 효과를 발휘한다(Einhorn 1995; Hadjiargyrou et al 1998). 지금까지 대부분의 시험은 표준 부분 슬개골절제술 토끼 모델을 이용하여 T-B 치유에 관한 LIPUS의 효과에 대해 연구되어 왔지만, ACL 재건의 토끼 모델을 이용한 시험은 매우 드물다(Table 1). 더욱이, T-B 치유에 관한 LIPUS 효과를 평가한 임상적 증거가 없다. 그러나 지금까지의 모든 동물 연구는 LIPUS가 대조군의 결과와 비교하여 초기 단계에서 T-B 치유를 유의하게 강화시킨다고 밝혔다(Lu et al 2006; Qin et al 2006a; 2006b; Walsh et al 2007; Lu et al 2008; Lu C.C. et al 2009; Lu M.H. et al 2009; Lovric et al 2012).

현재 연구의 한계 및 미래 관점(Limitations of the current study and future perspectives)

반건양근과 박근 건을 이용한 ACL 재건술은 최근에 대중화되어 사용되고 있다. 그러나 골 터널 내로 생물학적 이식물을 통합하는 것의 실패가 계속 발생하고 있다(George et al 2006). ACL 재건은 수술적으로 형성된 골 터널에서 건 이식물의 치유를 필요로 한다. 모세혈관에 해로울 수 있으며 부적절하게 계획 시 피부 반응을 야기시킬 수 있는 쇼크 웨이브(충격파)와는 달리, LIPUS는 부작용을 보이지 않고 우수한 환자 준수를 보인다(Yan et al 2011). 만약 임상 시험 결과가 T-B 치유를 자극하는데 효과적으로 보인다면, 환자는 휴대용 LIPUS로 가정에서 물리 치료를 받을 수 있을 것이다. 더욱이, 슬개골의 분쇄골절에서 슬개골 건-슬개골 복합체 파열, 아킬레스 건 파열, 회전근 상해와 같은 다른 T-B 결합 수복에 LIPUS 적용을 추론하는 것은 합리적이다. in vitro와 in vivo를 포함한 연구들은 LIPUS가 T-B 접점에서 치유를 촉진할 수 있다는 고무적인 결과를 보여왔다. 그러나 골-건 결합부에서의 효과는 주로 골에서 발생할 수 있다. 그러나 최근의 동물 모델 시험은 관절액의 존재로 인해 사람에서 ACL 재건 동안 발생하는 복잡한 관절내 환경을 재현하지 못한다. 더욱이, ACL 재건 수술을 겪는 환자에 대해 최적의 LIPUS 치료 양식은 아직도 결정 중이다. 미래의 연구는 LIPUS를 적용할 지시사항을 확립할 필요가 있을 뿐만 아니라 동물 모델 실험과 임상 시험에서 LIPUS의 효과와 적절한 기간을 확인하는 것이다. T-B 결합부에 대해 LIPUS의 표준화된 강도와 용량으로 임상 시험에서의 적절한 고품질의 증거가 요구된다. 재활을 가속화하고 정상 생활로 좀 더 빨리 돌아가기 위해, LIPUS가 가정에서 T-B 터널 치유를 자극하기 위해 사용될 수 있는 것은 가능한 일이다.

시험	동물모델 )	치료	결과
Lovric et al (2012)	거세숫양 (극하근건은 내측 로우 및 외측 푸쉬-인 봉합 나사못을 이용하여 골통과-등가 봉합-교량 구축으로 수복됨	20분/일 28일 동안	조직학: 대조군과 비교하여 LIPUS-처리군에서 T-B 접점에서 형태학적으로 해면질골을 닮은 새롭게 형성된 무층골의 두꺼운 부분이 골 표면을 따라 골아세포 활성이 증가된 채로 나타났다. 면역화학조직: VEGF와 RUNX2의 발현 패턴이 대조군과 LIPUS처리군 사이에 유의한 차이를 나타내었다.
Lu C.C. et al. (2009)	토끼 (토끼의 장지신근 건이 양쪽 근위 경골에서 골 터널 내로 이식됨)	20분/일 12주 동안	생체역학적 검사: 수술 2주 후에, LIPUS 군의 평균 최대 인장강도는 대조군에 비해 유의하게 높았다. 조직학적 결과: 12주에 T-B 접점은 LIPUS군에서 뼈에서 미네랄화된 연골 및 비-미네랄화된 섬유연골까지 새로운 골 형성의 이행 영역이 나타났다.
Lu M.H. et al. (2009)	토끼 (확립된 가로 부분 슬개골절제술이 토끼에서 수행되었음)	20분/일 6주 동안	방사선 상에서 측정된 새로운 골 크기: 남아있는 슬개골로부터 방사선상 새로운 골의 크기는 18주에서 대조군과 비교하여, LIPUS 군에서 유의하게 좀 더 많은 새로운 골이 형성된 것을 보였다. pQCT로 측정한 BMD: LIPUS 처리 군은 대조군에 비하여 6주째 새로운 골에서 유의하게 좀 더 높은 용적의 BMD를 보였다. 초음파 물-제트 압입 시스템으로 측정한 강도: LIPUS 군의 슬개골 연골의 강도는 수술후 6주째 대조군에 비해 유의하게 높은 것으로 관찰되었다.
Lu et al. (2008)	토끼 (표준 부분 슬개골절제술이 토끼에서 수행되었음)	20분/일 16주 동안	VEGF 발현: 4주째, 연골세포 및 골아세포는 LIPUS군에서 대조군에 비하여 유의하게 더 높은 VEGF를 발현하였다. 연골 형성: LIPUS 처치군은 16주째에 대조군에 비교하여 유의하게 더 두꺼운 섬유연골 영역을 보였다.
Walsh et al. (2007)	양 (양의 오른쪽 발굽으로부터 단일 발가락 펴짐근 건 자가이식체가 양쪽 경골 및 대퇴 골 터널 내로 이식됨)	20분/일 3,6,12주 동안	기계적 시험: LIPUS 치료는 26주째에 대조군과 비교하여 유의하게 더 큰 피크 로드와 더 강경하게 되었다. 조직학: 26주에 LIPUS처치군에서 접점에서의 새로운 골의 증거는 대조군과 비교하여 유의한 차이를 밝혔다.
Lu et al. (2006)	토끼 (표준 부분 슬개골절제술이 토끼에서 수행됨)	20분/일 2,4,8,16주 동안	기계적 시험: LIPUS는 대조군과 비교하여 T-B 결합부의 인장 기계적 성질을 유의하게 향상시켰다. 조직학적 분석: 형광현미경 평가는 대조군과 비교하여 LIPUS 처치 검체에서 8주와 16주째에 새롭게 형성된 골이 더 빠르고 강한 것으로 밝혔다. 새로운 골 형성: 유의하게 많은 새롭게 형성된 골이 8주와 16주에서 대조군과 비교하여 LIPUS군에서 관찰되었다.
Qin et al. (2006a	토끼 (표준 부분 슬래골절제술이 토끼에서 수행됨)	20분/일 8,16주 동안	방사선 상에서 측정된 새로운 골 영역: LIPUS 군은 8주와 16주 모두에서 대조군과 비교하여 유의하게 더 많은 새로운 골 형성을 유도하였다. 미세-압입으로부터 얻은 비커스 경도: 대조군과 비교하여, LIPUS 군에서 새롭게 재생된 섬유연골 영역, 치유된 건, 연골성 화생의 비커스 경도가 16주에 유의하게 높았음을 확인하였다.
Qin et al. (2006b)	토끼 (표준 부분 슬래골절제술이 토끼에서 수행됨	20분/일 8,16주 동안	방사선 상에서 측정된 새로운 골 크기: 유의하게 더 많은 새로운 골이 8주와 16주 모두에서 비처리된 대조군과 비교하여 LIPUS에서 형성되었다. pQCT에 의해 측정된 BMD: LIPUS 처리군은 대조군과 비교하여 8주재에 새로운 골에서 유의하게 더 높은 용적 BMD를 보였다. 기술적 조직학: 형광현미경 관찰은 대조군 샘플과 비교하여 LIPUS처치된 샘플에서 8주째에 칼세인 그린 라벨과 비교하여 더 많은 자일레놀 오렌지 라벨을 밝혔다.